为何要进行细胞毒性实验研究
在进行相对耗时和昂贵的体内研究之前，细胞毒性分析是对ADC分子进行筛选的必要的第一步。当细胞暴露在ADC分子下时，抗原表达细胞可以有效地吸收这些分子，并最终因释放的毒素而死亡。ADC的这种细胞毒性可以通过测量潜伏期结束时活细胞的百分比来评估。四唑比色法(MTT)是一种应用广泛的细胞活力测定方法。本文我们将描述如何使用MTT法来测量ADC的细胞毒性效应，并计算相应的IC50。ADC除了对抗原表达细胞具有细胞毒性外，还能在抗原表达细胞附近表现出旁观者杀伤抗原阴性细胞的行为(旁观者效应)。本文还将会介绍借助荧光蛋白转染抗原阴性细胞实验来评估ADC的旁观者效应。
在药物分子如ADC的开发过程中，细胞毒性实验是一个必不可少的实验，它影响细胞增殖或显示直接杀伤作用。它是筛选有前途的ADC候选细胞、预测ADC体内疗效和评估细胞特异性的重要方法。细胞毒性试验最重要的结果是实验结束时剩余的活细胞或死细胞的数量。有几种方法可用于测量这一结果，包括四氮唑还原、白砂糖还原、蛋白酶标志物和ATP检测。本文我们介绍使用MTT方法测定细胞毒性，这也是最常用的细胞毒性测定法之一。MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲瓒晶体，甲瓒晶体的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还原生成的甲瓒晶体可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
不能忽视的旁观者效应
为了对ADC进行深入的细胞毒性评估，最好使用抗原阳性（Ag+）和抗原阴性（Ag-）细胞系。由于ADC分子较大且极性相对较强，它们不易通过细胞膜，而是依靠与细胞表面抗原结合进入细胞。因此，预测ADC在Ag+细胞系比Ag-细胞系中毒性更大。但是，由于旁观者效应，一些ADC同样可以杀死Ag+细胞周围的Ag-细胞。这种现象源于ADC在Ag+细胞周围降解产生的细胞毒性载荷的扩散。具有可切割连接子和疏水载荷的ADC，一般具有旁观者效应。例如布伦妥昔单抗(SGN-35)含有一个val-cit连接子和MMAE作为载荷。为了评估ADC的潜在安全问题，评估其体外旁观者效应也很重要。
图1.不具有（上半部分）和具有（下半部分）旁观者效应ADC的作用示意图。
有两种不同类型的检测方法可用于评估ADC的体外旁观者效应:(1)共培养试验，(2)介质转移法。细胞共培养（co-culture)是将两种细胞（Ag+、Ag-）（可以来自同一种组织，也可以来自不同的组织）混合共同培养，比较Ag-在共培养系统和单一培养系统中的活力，可以用流式细胞检测。介质转移法是先用一定量的ADC处理Ag+细胞，一段时间后，将该介质转移到Ag-细胞。如果来自Ag+细胞的介质对于Ag-比直接用同样浓度的ADC处理体现出更好的杀伤效果，那么就可以说明具有旁观者效应。为了更详细的说明细胞毒性实验，接下来从如何使用MTT法在单一培养系统中评估ADC的细胞毒性以及如何评价绿色荧光蛋白转染Ag-在共培养体系中ADC的体外旁观者效应进行展开说明。MCF7(Ag-)和N87(Ag+)细胞，培养基及其他材料和试剂等这里不再详述。确定最佳细胞计数和孵育时间
细胞密度1*10的6次方/ml，梯度稀释：1*10的6次方/ml到1*10的3次方/ml。3复孔，每孔100ul，做好空白质控，37℃孵育6-24h。每孔加入20ul 5mg/mlMTT，37℃孵育1-4h。加入100ul，10%SDS-HCl，37℃孵育过夜，读取570nm处的吸光度。取各细胞数组的平均吸光度值，减去空白的平均值。绘制吸光度与细胞数的关系图。利用MTT在单一培养系统中研究细胞毒性
96孔板中每孔加1000–10,000个细胞（50ul媒介体系），按照图2实验分为6部分：Ag+和Ag-细胞空白体系，Ag+质控，Ag-质控，经ADC处理的抗原阳性和阴性组。空白孔用培养基代替。对于每个细胞系，有三个主要组:空白组(仅培养基);未经处理的细胞质控和ADC处理的细胞。
图2 MTT单培养试验典型的板布局
37℃，5%CO2过夜孵育使细胞结合。制备不同浓度的ADC，在每个孔中加入制备好的ADC溶液50 μL。空白孔和对照孔分别加入50 μL新鲜培养基，37℃孵育48-144h。每孔加入20ul 5mg/ml的MTT，37℃孵育1-4h(根据最佳检测结果)。加入100ul，10%SDS-HCl，37℃孵育过夜，读取570nm处的吸光度。计算不同ADC浓度下的细胞活力，以ADC的浓度为横坐标，细胞活性为纵坐标。将数据拟合为s型曲线，得到IC50值（见图3和图4）。
图3.使用曲妥珠单抗-vc-MMAE作用后的N87(Ag+)活性曲线
图4.使用曲妥珠单抗-vc-MMAE作用后的MCF7(Ag-)活性曲线
共培养体系中研究ADC的旁观者效应
通过以上单一培养系统实验可以得到Ag+和Ag-的IC50。用于旁观者效应的ADC浓度应大于抗原阳性细胞系的IC90，小于抗原阴性细胞系的IC50。这里，Ag-细胞系需要用荧光蛋白转染，可以用绿色荧光蛋白(GFP)转染细胞系。首先需要制备Ag+和GFP 转染的Ag-细胞系。按照图5，实验分为7部分：空白， Ag-细胞组，5组不同抗原阴性细胞百分率的共培养组（90%, 75%, 50%, 25%, 10%），同时分为ADC处理和非ADC组（质控）。
图5.共培养旁观者效应分析的典型平板格式
除空白组外，每孔细胞密度10000个/孔。空白组只加入100 μL新鲜培养基。37℃，5%CO2过夜孵育。弃去孔内介质，加入100ulADC到孔内，100ul新鲜的培养基到控制孔。37℃，5%CO2孵育48h。读板，激发波长485nm，发射波长535nm。后续继续37℃，5%CO2孵育（96h、144h）。每孔内的荧光强度值通过减去空白组的读数归一化。ADC处理孔的荧光值除以未处理孔的荧光值，得到活力值%（见图6）。
图6.a:Ag-在N87(Ag+) 和MCF7(Ag)共培养体系中不同比例不同时间下的活性，Ag+细胞比例越高，旁观者效应越明显。b:Ag-在单时间点（144h）下的活性。每个共培养组分毒性比单独Ag-更高。注意事项
1.MTT在DPBS中缓慢溶解，旋涡搅拌约5-10分钟。避光保存，4℃短期使用，-20℃可使用1个月。2.细胞培养基很多含有酚酞红，会干扰检测，0.01 M的HCl可以消除这种干扰。3. 由于SDS是一种清洁剂，溶解这种化学物质会产生气泡。为了避免这些气泡，避免严重的漩涡或搅拌。加热可以帮助溶解SDS。一般情况下，制备10% SDS后，加入0.01 M浓度的HC，此溶液可在室温下保存。4.在用于细胞毒性分析之前，细胞应保持良好状态(95%以上存活)。解冻后请勿立即使用。在进行MTT试验之前，细胞至少应传代培养一代。5.如果使用贴壁细胞，确保细胞均匀地在孔内分布并形成单层，将移液器贴壁（30°）慢慢加入。6. 评估不同的MTT孵育时间(如1、2和4 h)，在一定范围内，MTT孵育时间越长，获得的吸光度和分辨率越高。然而，当细胞密度过高时，MTT底物会耗尽，甲臜的产生与细胞活力之间的线性关系会发生偏离。当进行MTT测定时，对照组在终点的吸光度为0.75-1.25最佳。7. 在筛选ADC疗效时，稀释系数为10较好。在明确了ADC的工作范围后，可以使用更小的稀释系数来得到更精确的IC50，因为这样可以提供更多的对数线性相位的点。8.在实验中决定ADC的浓度范围时，药物抗体比(DAR)也是一个重要的考虑因素。DAR值为4的ADC比DAR值为2的ADC表现出更强的体外细胞毒性。因此，使用载荷浓度(ADC浓度* DAR值)而不是ADC的浓度，即使用有效载荷IC50作为参考来设置浓度范围更合理。9. 如果有效载荷是微管蛋白抑制剂(如MMAE或MMAF)， 72或96 h更适合评估这些药物的细胞毒性，因为这些有效载荷需要细胞周期阻滞并导致延迟的细胞杀伤。DNA损伤载荷(如PBD或calicheamicin)可以更快地诱导细胞死亡。10. 在进行共培养试验之前，这些细胞需要在不含抗生素的正常培养基中适应一段时间。11.与直接细胞毒性试验相比，观察旁观者效应需要时间，有时可能需要3周，旁观者效应要求负荷从ADC中分离出来，渗透到附近的Ag-中。因此，在实验过程中加入培养基会稀释自由载荷浓度，从而影响旁观者效应，这点要引起重视。12.为评价旁观者效应，只需要使用Ag-比较细胞活性。如果在共培养体系中差异明显且存活率较低，则表明ADC分子具有旁观者效应。对于一些ADC，只有当Ag+细胞比例大于50%时才能观察到旁观者效应。参考文献 1.Shengjia Wu and Dhaval K. Shah ，Determination of ADC Cytotoxicity in Immortalized Human Cell Lines，329-340. 2.Marshall NJ, Goodwin CJ, Holt SJ (1995) A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regul 5:69–84. |
— 777永利总区医药ADC药物研究平台 —
777永利总区医药ADC药物非临床评价研究平台具有支持ADC药物研发立项、工艺和化合物筛选、IND申报不同阶段成熟研究策略和全套解决方案，覆盖药代动力学、药效学、毒理学，同时配备高水平的专业科研团队和一流的技术平台：如LC-MS/MS、LC-QTOF-MS、放射性同位素示踪分析仪、MSD、酶标仪、流式细胞仪等，已与多家大型ADC生物制药企业开展合作，现有多个品种在研，研发和注册经验丰富。
