免疫原性（Immunogenicity）是指药物和/或其代谢物诱发对自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。当治疗类蛋白产品作为药物时，会被机体识别为外来物质而产生免疫应答，但对于治疗性蛋白的不必要或非预期的免疫应答则会给药物的安全和疗效带来风险，甚至会因为抗药抗体和内源蛋白交叉给病人带来生命危险。

机体的免疫反应通常包括两种类型，一种是固有免疫，主要包括皮肤、粘膜及体液中的杀菌物质所构成的第一道和第二道防线。另一种为适应性免疫，又称特异性免疫，也是免疫原性研究主要讨论和监测的范畴。适应性免疫主要包括体液免疫（通过B细胞介导产生特定ADA）和细胞免疫（通过T细胞介导释放细胞因子）。对于大多数药物，不良免疫反应通常由体液免疫介导，但对于细胞基因治疗类的产品，除体液免疫外，还需要更多的关注细胞免疫。

免疫原性研究中检测的抗体通常包括:(1)抗药抗体(Anti-Drug Antibody,ADA):通常特指抗药结合抗体;(2)中和抗体(Neutralizing Antibody,NAb):是指能够干扰药物与其靶点相互作用的抗药抗体。中和抗体往往能够极大的降低或中和药物的药效作用，所以必要情况下还需要开展中和活性试验评估抗药抗体对药物的中和能力/程度。当然，除了疫苗类产品以外，中和抗体通常都是非预期产生的抗体。

1.1内源性因素

• 药物的氨基酸序列：相比于人源化氨基酸序列，非人源氨基酸序列的药物更易产生ADA。
• 结构修饰：为了增强疗效或改变半衰期，人为对序列进行结构修饰（包括唾液酸修饰、氨基酸位点突变、去海藻糖、融合蛋白、PEG化等）。这些结构变化均是引起免疫原性发生的风险因素。
  
  
  1.2外源性因素
  
  
• 产品工艺：多聚体、杂质、去末端氨基酸和降解。如药物产品在制备过程中引入了较高水平的杂质，包括多聚体、降解产物、变性蛋白等，则ADA的发生率会相对高一些。
• 制剂：辅料、包装材料等。
• 治疗相关因素：如给药途径、频率等。相比于静脉、口服给药，通常采用皮内、吸入给药的途径更易产生ADA；连续多次给药相比于单次给药ADA的发生率通常更高些。
• 患者相关因素：自身免疫性疾病患者的免疫系统通常处于激活状态，一般更易产生ADA，相反如患者的免疫系统处于抑制状态，则不易产生ADA。

免疫原性的产生影响广泛，从无临床意义抗药抗体的暂时出现，到能够改变药物药效或产生副作用，甚至严重到危及生命。主要影响以下几方面：

• 安全性：ADA的产生会导致机体发生药物过敏反应；对于免疫调节类药物，可能会导致免疫细胞过度活化，促炎性因子快速释放而引发细胞因子风暴；抗原抗体复合物的形成也会带来安全风险。
• 药效学：中和抗体的产生可能降低或中和药物疗效，改变药物生物分布。
• 药动学：改变组织分布，改变清除率及体内暴露量，干扰血药浓度测定。

免疫原性研究贯穿药物研发、非临床研究、临床研究、上市后药物监测的整个生命周期，是药物研发的重要组成部分。在免疫原性全程式研究中，应始终关注抗药抗体生成与药代/药效动力学、疗效以及安全性之间的相关性。

治疗性蛋白药物通常具有种属差异，基于动物免疫原性研究结果预测人体免疫原性具有局限性。但是，在非临床研究中进行免疫原性评价仍然具有一定意义。免疫原性相关反应可导致非临床研究结果复杂化并难以解释，免疫原性数据有助于安全性数据的整体解读和分析。而临床试验中对于抗药抗体的检测更是成为了药监局的监管要求。

• 评价药物通常包括治疗性蛋白、多肽及其衍生物、ADC、细胞产品、基因治疗药物、病毒载体类药物等。
  
• 免疫原性为定性研究，主要聚焦在抗药抗体的检测和表征。通常应获得ADA的发生率、滴度、存续时间和中和能力等数据；必要时可对抗体同种型、亚型、结合表位或与内源性蛋白的交叉反应性进行确认。
  
• 免疫调节类药物需对动物体内毒性试验中的相关细胞因子变化水平进行监测，并开展体外细胞因子释放试验。

ADA产生的机制主要包括两种：T细胞依赖途径和T细胞非依赖途径。

• T细胞依赖途径：药物作为抗原被抗原提呈细胞（APC）摄取内化，加工为抗原多肽片段；多肽-MHC II类分子与T细胞表面受体（TCR）识别并结合，激活T细胞；T细胞活化诱导B细胞增殖和分化为浆细胞，合成并分泌特定ADA（IgG）。此类型ADA免疫应答作用强，持续时间长。
  
  
• T细胞非依赖途径：药物可直接作用B细胞表面受体（BCR），诱导B细胞分化浆细胞；同时树突细胞也可将药物提呈至B细胞，诱导B细胞分化浆细胞，合成并分泌特定ADA（IgM为主）。因为该途径没有T细胞辅助，产生的ADA主要为IgM型，亲和力低、持续时间短、特异性差，且比T细胞依赖途径的免疫应答作用弱。

图1. ADA的产生机制^[1]

ADA即为抗体，抗体是机体免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖、分化成的浆细胞产生的效应免疫分子。抗体介导体液免疫，主要分布在血清中，是可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

根据产生的抗体重链的不同，ADA通常分为以下五种类型：IgG、IgE、IgM、IgA、IgD。各个抗体类型的特点如下表所示。

在ADA分析方法开发之前，应充分了解目标待测物，根据受试药物性质及特点选择合适的分析方法，通常包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、电化学发光法（ECL）、放射免疫分析法（RIA）、表面等离子体共振检测法（SPR）、全自动纳升级免疫分析工作站Gyrolab等。其中，应用最为广泛的方法主要包括ELISA法和ECL法。

• 直接ELISA：此法的优势在于能够增加低亲和力抗体的检测，但缺点是仅能检测单一亚型，且具有种属特异性。
  
  
• Bridging-ELISA：此法的优势在于能检测各类抗体亚型，无种属特异性，可高通量检测，缺点是不易检测到低亲和力的抗体。目前，该法也是业内ADA检测应用较为广泛的方法。

  
  

• ECL法：该法基于MSD平台，优势在于可以检测所有亚型，无种属特异性，同时可以检测低亲和力抗体，灵敏度和耐受性高。所以，这种方法在临床检测中的应用也比较广泛。

图2. ELISA和ECL法检测ADA的原理示意图

NAb的检测方法通常包括两种，一种是基于细胞的生物学试验(cell based Assay，CBA)，一种是非细胞的配体竞争性试验(non-cell competitive ligand-binding assay，CLBA)。这两种方法的选择通常基于以下几个因素：①由药物类型和药物作用机理（MOA）决定；②方法性能（如数据的可靠性）；③药物免疫原性的风险。目前，CBA法是被监管部门认为是衡量药物产生中和抗体倾向的金标准。但对于拮抗型单克隆抗体通常首选CLBA（通过结合发挥作用的），受体激动剂的药物或者ADC药物推荐首选CBA。以下为两种方法优劣势的比较。

欧洲药品监管机构（EMA）于2007年发布首版免疫原性评价的指导原则，并于2017年发布最终版本，适用的范围包括蛋白质、多肽及衍生物等。该版本对于免疫原性分析的技术细节并未作过多规定，申办方可根据适用目的原则选择最优的方法来满足监管要求。

美国FDA于2014年首次发布了免疫原性评价指导原则。2016年，为适应行业的发展及审评要求，又发布了针对ADA检测方法开发和验证的指导原则草案并于2019年正式生效。

国家药品监督管理局（NMPA）于2020年08月发布了《药物免疫原性研究技术指导原则（征求意见稿）》，并于2021年03月发布正式版本，填补了我国免疫原性研究相关技术规范的空白。该版指导原则中对于免疫原性的整体评估策略与EMA、FDA指导原则基本一致，不同之处在于NMPA正式版对非临床和临床免疫原性分析方法的差别作了较为详细的区分。

此外，相关组织协会（如欧洲生物分析论坛）也会定期召开行业会议，发布免疫原性方面的白皮书，这些白皮书针对免疫原性的热点问题也会给予诸多指导。

图3.免疫原性多层级策略示意图

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