一、生物标志物的定义及分类
生物标志物通过检测可以反映人体生理或病理过程的客观指标而应用于临床，有助于疾病的早期诊断、分类判断、疗效监测、个体化用药等，在疾病防治和提高医疗质量方面具有重要作用，也是药物研发过程中不可或缺的工具。生物标志物的开发和利用是精准医学发展的重要内容。
生物标志物按照分类可在临床中扮演不同的角色。
【图1】生物标志物的分类
二、生物标志物的临床应用
1. 药效学研究：通过检测生物标志物的变化，可以判断新药对疾病过程或靶点的生物学效应，预测其临床疗效。如检测肿瘤标记物CEA、CA199的下降，可以初步判断抗肿瘤药物的疗效。
2. 安全性评价：监测生物标志物的异常变化，可以早期判断新药的毒副作用和安全窗，帮助确定药物的最大耐受剂量，为后续临床研究提供依据。如血常规、肝肾功能指标用于药物的安全性评价。
3. 疗效指标：某些生物标志物的表达与疾病活性或预后密切相关，其改变可以作为新药研发的疗效评价终点，指导临床试验的设计。如血糖控制情况为血糖药物研发的重要疗效指标。
4. 个体化用药：检测患者特异的生物标志物，可以选择最佳的用药剂量或患者人群，实现对新药个体化管理。如EGFR mutation状态决定了EGFR抑制剂的适应证和用量。
5. 临床转归相关性：一些生物标志物的变化与患者远期的临床转归密切相关，可用于评价新药对长期生存率和生活质量的影响，更全面地反映新药的临床价值。
6. 获批要求：药品监管机构对许多新药的上市批准提出生物标志物相关的要求，开发者需在临床试验中进行生物标志物检测并证实新药对其的影响，这也推动了生物标志物在新药研发中的应用。
三、生物标志物的开发时机
通常，生物标志物的开发应与药物临床研发并行，根据患者人群的疾病特征、药物作用机制和安全性特征，开发不同的单个或多个生物标志物，加速抗肿瘤新药研发。
2. 关键临床试验阶段：建议根据早期临床试验阶段中生物标志物的研究分析结果，明确是否采用某种生物标志物进行人群的富集，并在关键性临床试验中进行确证。同时建议探索更多其它生物标志物，有助于进一步理解药物作用特点及耐药机制等。
四、生物标志物的开发流程 五、生物标志物验证方法的分类 六、生物标志物的检测方法 1.实时荧光定量核酸扩增检测(Real-time Quantitative PCR Detecting System, qPCR) 是常规聚合酶链式反应PCR技术的升级版，通过监控PCR反应体系中途产生荧光信号的强度，实时监测PCR反应过程中目标分子的数量变化。该技术具有快速、准确、灵敏、高通量和高自动化等特点，广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测、拷贝数变异分析等领域。 技术原理：在PCR反应中添加一定浓度的荧光探针，使其与扩增产物靶标的结合，即可产生强荧光信号。反应进行过程中，荧光信号强度与扩增靶标量成正比。PCR反应体系中加入双链DNA结构和荧光探针，因此反应进行过程中扩增物会降解荧光探针，从而发出特定的荧光信号。这个荧光信号强度与PCR反应体系中反应产生的数量成正比，因此可以通过计量初始模板数量来对样本中的总量进行定量。 应用领域：检测DNA和RNA的定量，包括基因表达、突变检测、体细胞测序、病毒检测以及细胞寿命检测等方面。如基因表达定量和分析，研究基因调控和功能；病毒、细菌和感染性疾病的检测，追踪病原体大量表达的特定基因；物种的DNA鉴定、认证和鉴别，如分子生态学和食品安全领域；检测某些人类遗传疾病、病理性基因突变和癌症等的诊断和筛查；检测基因工程产品和转基因食品中的外源基因。 技术优势：qPCR技术具有实时监测、快速、灵敏、高通量、准确性高、自动化程度高等优点。该技术能够在PCR反应过程中持续收集和分析荧光信号，实现即时、动态地监测PCR扩增的过程和反应结果。其灵敏度更高，能够检测非常低的核酸浓度，检测下限可达到一两个分子，同时也可定量非常高的核酸浓度。由于该技术过程可自动执行，每个样品反应时间一致，消除了人为误差，因此具有很高的准确性、可重现性和准确性等显著优势，成为分子生物学和临床医学研究的重要工具。 2.流式荧光技术（Luminex） 是一种基于荧光标记和微珠子技术的分析方法，能够快速、高通量地检测多种生物分子（如蛋白质、核酸、激素等）的存在和定量。该技术采用基于珠子表面标记的识别系统，并通过激光和光传感器实现对荧光标记的高通量定量。这种技术广泛应用于基因组学、蛋白质组学、细胞生物学等领域，尤其在临床诊断和治疗方面有着广泛的应用。使用不同染色微球和流式细胞术原理，可实现同时检测100个生物标志物。 技术优势：检测高效，选择指标多，能够实现核酸和蛋白质检测的应用，同一个Panel内可自由组合待测因子，可同时检测数十种待测分析物；灵敏度高，精确定量下限低至0.1 pg/mL；样品用量少，只需低至25μL的样品体积；稳定性高，不同组合配有独特优化的缓冲液，可有效减少假阳性；技术成熟：金标准验证，与Quantikine进行相关性验证，且有QC control对照。 3.流式细胞术(Flow cytometry) 该技术操作简便、灵敏度高、定量准确，已广泛应用于细胞生物学和生物医学研究，它在免疫治疗生物标志物的检测与研究中发挥了重要作用。 技术优势：对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测、测量速度可达每秒数千甚至上万个细胞；灵敏度高，每个细胞上只需带有1000~3000个荧光分子即可检测出来；精密度高，相比其他检测技术，流式的变异系数更小，分辨率更高，可在保证细胞不被破坏的情况下进行分析；可以把制定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达99%以上。 4.酶联免疫分析（ELISA） 是一种利用特异性抗体和酶的偶联反应检测生物分子的技术。很早被应用于体液样本临床蛋白标志物检测的技术，使用简单方便，在实验室应用广泛，已经使用了几十年，因而也被当成“金标准”来使用。酶联免疫分析类型包括：直接法(Direct ELISA)、竞争法(Competitive ELISA)、间接法( Indirect ELISA )和夹心法(Sandwich ELISA)。 技术优势：操作简单，且样品处理方便，且其对于分析物的灵敏度高、特异性好，而且检测结果快速且准确可靠，能够被自动化的处理和分析。 5.电化学发光反应器（MSD） 利用电化学发光原理，灵敏度高、背景低、线性范围广。同时通过每个小孔不同位点包被不同抗体来实现多重检测，一次可以检测10个多因子。 技术优势：MSD为电化学发光，具有更好的信噪比；具有更宽的检测范围；同一反应孔内可进行多个因子的检测；具有严格的质控检测试剂。 6.免疫组化（IHC） 一种广泛应用于组织和细胞研究中的技术，它可以为研究人员提供有关细胞类型、分子组成、表达和亚细胞定位的重要信息。IHC可用于许多疾病研究和分子诊断，是生物医学领域中的一项重要工具。 技术优势：样品处理简单，操作性较强；只需要少量的样本就可以开展实验；可以同时检测多种不同的物质；可以使用多种常规的组织染色方法，如荧光染色、酶标记染色等等。 7.液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 结合了液相色谱的分离能力和质谱的分析能力，可以高灵敏和高选择性的进行化合物的分析，是目前在生物分析领域中广泛使用的高通量分析技术。 技术优势：检测灵敏度高，能够检测到低浓度的化合物甚至轻微的化学变化；显著提高了检测效率和准确性，尤其适用于样品分离和分析；能够同时鉴定和定量多种化学物质，提供更详细和全面的分析结果；操作简单、效率高和可重复性好，且标准化程度较高，可以大规模生产和商业化应用。 结语 在药物研发的不同阶段，生物标志物均有广泛的运用。生物标志物可用于候选药物的筛选，减少药物研发成本，避免药物在后期临床阶段失败的重大损失。生物标志物还可用于疾病的鉴定和诊断、病人筛选和治疗效果预测、监控治疗进程和疾病进程以及反映治疗效果等各个方面。 777永利总区医药临床药理学实验室可以为客户提供生物标志物检测的一站式专业实验室服务；同时支持项目管理、数据管理和样本运输管理服务，为新药临床研究提供高质量的数据支持，帮助客户对其临床试验做出更好，更快的决策。
4. 验证临床样本：在临床样本中能可靠地检出生物标志物以识别预期的目标患者，主要验证生物标志物检测方法在患者样本检测中的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等。
5. 临床试验确证：基于不同功能的生物标志物应用目的不同，通常需要通过前瞻性随机对照研究数据来确证，应有事先设计的统计分析计划，并有足够数量患者的生物标志物检测数据支持分析和决策。
2. 高级方法验证：安全性和诊断性生物标志物可能在药物开发的所有阶段发挥关键作用。这些生物标志物的量化可能需要对分析方法性能有更高的可信度，因此可能需要在使用前结合探索性生物标志物验证进行高级方法验证。
技术原理：通过使用不同配比的两种红色荧光染料将聚苯乙烯微球染成不同的荧光，获得多个荧光编码的微球，进而针对不同待检测分析物的捕获抗体共价偶联到特定的编码微球上，加入待检样本及生物素标记的抗体，所形成的抗体复合物再与荧光素PE发生反应，通过Luminex机器采集荧光信号对最后的样本进行定量。
应用领域：Luminex主要应用于PD多因子检测等领域，生物标志物的筛选，癌症、代谢、免疫、神经性疾病的研究等方面发挥重要作用。
技术原理：将全血、组织样本等制成单细胞悬液，细胞在流式细胞仪的激光的照射下产生相应的散射光和激光信号，计算机分析系统会接收的不同光信号进行分析处理。
应用领域：流式在细胞DNA含量检测、细胞表型分析、细胞功能分析、细胞表面或胞内蛋白分析、红细胞疾病的诊断、可溶性蛋白检测、细胞的分选等发挥重要作用；细胞动力学研究（抗体修饰NK细胞，CAR-T/NK细胞等）；抗体内吞研究等。
技术原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
应用领域：细胞因子检测，如白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等；心肌梗塞检测，如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等；内分泌检测，如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等；肝纤维化检测，如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等；自身免疫检测，如甲状腺，盐水可提取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，ELISA试剂盒蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体等。
技术原理：MSD电化学发光技术检测技术使用SULFO-TAG标记物，在MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT微孔板的电极表面通电后，电化学作用激发SULFO-TAG标记物发出强光。
应用领域：MSD主要应用于PK（灵敏度要求高的药物）、ADA、PD多因子检测等领域。在心脑血管疾病、免疫/炎症、代谢性疾病、神经退行性疾病、癌症、细胞内信号通路等研究相关领域发挥重要作用，涉及HER2、PD-1/PD-L1等热门靶点。
技术原理：利用抗体的特异性与组织或细胞中的特定抗原结合，并通过标记物（如酶或荧光）的特异性检测抗原的位置和表达情况。IHC主要包括以下步骤：样品处理、抗原恢复、阻断和抗体处理、标记物检测、暴露和成像等。
应用领域：检测组织和细胞中的蛋白质表达情况以及定位，可以了解蛋白质的分布情况、表达量和亚细胞定位等信息。特别是在癌症的研究中，可以用于诊断、估计患者的预后情况以及选择治疗方式。除此之外，IHC 技术还可应用于检测细胞信号传导、炎症反应、自身免疫性疾病、感染病等等。
技术原理：液相色谱用于分离复杂样品，质谱检测器用于检测分离后的化合物，以确定分子的质量和结构。
应用领域：用于分离和鉴定某种特定化学物质的结构和含量，如不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定。被广泛应用于许多领域，如临床诊断、药物研发、食品安全、环境污染等。
