阿兹夫定联用多替拉韦钠在中国健康受试者中的药代动力学研究
Pharmacokinetic study of azvudine in combination with dolutegravir in Chinese healthy subjects
作者：汪 云1，吴金伶2，马莎莎2，李 敬1，何斌源2，万元浩2，李雪珂3，龙正威3，崔 桅1
( 1. 天津市人民医院Ⅰ期临床试验研究室，天津 300121; 2. 河南真实生物科技有限公司，河南 平顶山 467036; 3. 上海浦济医药科技有限公司，上海 200131)
来源：中国临床药理学杂志. 第39卷 第13期 2023年7月(总第387期)
摘要 目的 评价健康受试者同时多次口服阿兹夫定(FNC) 和多替拉韦钠 (DTG) 后，DTG对FNC及FNC对DTG药代动力学的影响。方法 本研究采用单中心、随机、开放、三周期、三交叉设计。入组15例受试者，随机分为3组，每组5例，每组受试者随机交叉多次服用FNC/DTG/FNC+DTG。采用液相色－串联质谱法( LC－MS /MS) 测定血浆中FNC和DTG的浓度。计算主要药代动力学参数并进行统计分析。结果 单用DTG和FNC+DTG联用时血浆中DTG的药代动力学参数:Cmax,ss分别为(4621.33±1248.27)和(4728.67±980.58)ng·mL－1，AUC0－t,ss分别为(97530.27±33757.28) 和(101136.63±31214. 96)ng·h·mL－1AUC0－∞,ss分别为(97477.76±31426.55)和(105485.81± 32827.57)ng·h·mL－1; 单用FNC和FNC+DTG联用时血浆中FNC的药代动力学参数:Cmax,ss分 别 为 (2.19 ±0.95)和(3.04±1.37)ng·mL－1，AUC0－t,ss分别为(2.72±0.85)和(3.25±1.03)ng·h·mL－1，AUC0－t,ss分别为(3.28±0.76)和(3.37±0.85)ng·h·mL－1。单用DTG和DTG+FNC联用时血浆中DTG的Cmax,ss、AUC0－t,ss和AUC0－∞,ss几何均数比值分别为103.68%、105.06%和104.38%;单用FNC与DTG+FNC联用时血浆中FNC的Cmax,ss和AUC0－t,ss几何均数比值分别为137.04% 和120.31%。结论 FNC对DTG的药代动力学无显著影响，DTG对FNC的药代动力学可能有显著影响。 阿兹夫定( azvudine，FNC) 能抑制人类免疫缺陷病毒( human immunodeficiency virus，HIV) 反转录酶与辅助蛋白病毒感染因子( viral infectivity factor，Vif)双靶点，选择性进入HIV靶细胞－外周血单核细胞( peripheral blood monouclear cells，PBMCs) 中的 CD4、CD14 细胞抑制病毒复制［1］。多替拉韦钠( dolutegra-vir，DTG) 是第二代整合酶抑制药，世界卫生组织及中国抗病毒指南推荐现为首选一线治疗 HIV 抗病毒药物［2］。本 试 验 根 据 FNC 药品注册审批意见( 2021S00826) 开展药物相互作用( drug－ drug intera-ction，DDI) 临床研究，在健康受试者中评价 DTG 和FNC 药代动力学的相互影响，为临床合理用药提供参考。 材料、对象与方法
本研究采用单中心、随机、开放、三周期、三交叉试验设计。试验共入组15 例受试者，随机分为3组，每组5例，早上空腹交叉口服 FNC 3 mg 或 DTG 50 mg或联用 FNC 3 mg + DTG 50 mg，每周期连续口服5 d，3组的 给药顺序分别为FNC+DTG/FNC/DTG、FNC/DTG/FNC+DTG和DTG/FNC+DTG/FNC。周期间的洗脱期为7d。
每天受试者以温水 240 mL 送服药物，服药前后1h禁水，服药后约 1、4 和10 h进食标准供应的早餐、午餐和晚餐。每周期的第 3 天和第4天于给药前(0h) 、第5天(D5) 于给药前(0h) 和给药后 0. 25、0. 5、0. 75、1、1. 5、2、3、4、6、8、12、24、48 h 采集上肢静脉血约 3 mL。在 4 ℃ 条件下以 1700 × g 离心10 min，抽取上层血浆分装至检测管及备份管中。血样采集后 2h 内，将血浆样本转移置于－60 ℃冰箱保存，待测。
FNC色谱条件 色谱柱: DIKMA Diamonsil C18柱( 5 μm，100. 0mm×4. 6mm) ; 柱温: 40℃ ; 流动相:A 为含1mmol·L－1乙酸铵和 0.1% 甲酸的水溶液，B为 0. 1% 甲酸的乙腈-甲醇=4∶1( v/v) 溶液; 进样量:5.00 μL; 流 速: 0.50 mL·min－1。梯度洗脱条件:0. 00～0. 50 min10% B; 1.70min 20% B; 2. 40 min40% B; 4. 50 ～5. 50 min 95%B; 5. 51 ～6. 50 min 10%B。
DTG 色谱条件 色谱柱: Agilent ZOＲBAXEclipse XDB － C18 柱( 5 μm，100. 0 mm × 4. 6 mm) ; 柱温: 40 ℃ ; 流 动 相: A 为 含 1 mmoL · L－1 乙 酸 铵 和0. 1% 甲酸的水溶液，B 为含 0. 1% 甲酸的乙腈溶液;进样量: 2. 00 μL; 流速: 0. 60 mL·min－1。梯度洗脱条件: 0 ～ 0. 50 min 60% B; 1. 80 ～ 2. 80 min 95% B;2. 81 ～ 3. 50 min 60% B。
质谱条件 电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测方式扫描，FNC 碰撞能量为 25 V，拉米夫定碰撞能量为 15 V，DTG 和 DTG － d5 碰撞能量均为 39 V。FNC 离子对为 m /z 287. 20→112. 20，拉米夫定离子对为 m /z 230. 10→112. 10，DTG 离子对为 m /z 420. 30→277. 10，DTG － d5离子对为 m /z 425. 30→277. 10。
血浆样品处理 样品在室温白光下融化后，涡旋混匀; 移取 50 μL 于 96 孔板中，加入内标溶液20μL和 0. 5% 甲酸的乙腈溶液430μL，充分震荡约10 min，在 4 ℃条件下以 2 000 × g 离心 10 min。移取上清液250 μL 于新的 96 孔板中，氮气 40 ℃ 吹干，加入乙腈－水 =1∶4( v/v) 溶液 250 μL，涡旋 10 min，在 4 ℃ 条件下以 2 000 × g 离心5 min，得进样板 1，用于 FNC 进行液相色谱－串联质谱法( liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC－MS /MS) 分析。取进样板1 的溶液 30. 0μL于新的 96 孔板中，加入乙腈－水 =1∶4( v/v) 溶液570μL，充分震荡约10 min，在 4 ℃条件下以 2000× g 离心5min，得进样板2，用于DTG进行LC－MS /MS 分析。
专属性 在样品测定条件下，空白血浆样本处理后，FNC 和内标 3TC 的保留时间为 2. 64min 和 2.36min，DTG 和内标DTG－d5的保留时间均为 1.17min，样品峰处均无干扰，血浆中内源性物质不干扰测定。色谱图见图 1。
标准曲线与定量下限 以待测物FNC(DTG) 与内标拉米夫定(DTG－d5) 峰面积的比值为纵坐标(y) ，以血浆中待测物浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，用加权(1/x2) 最小二乘法进行线性回归。FNC血浆标准曲线的质量浓度均为 0. 20、0. 40、1. 00、5. 00、20. 0、40. 0、80. 0 和 100ng·mL－1，回归方程为 y =1. 48×10－2x－0. 20×10－4(Ｒ2 = 0. 9979) ，FNC 的线性范围 为 0. 20～100 ng · mL－1，定 量 下 限 为 0. 20ng·mL－1。DTG 血浆标准曲线 的质量浓度均为10. 0、20. 0、50. 0、250、1000、2000、4 000 和 5 000ng·mL－1，回归方程为 y = 2.08 × 10－3x + 3.13 × 10－4(Ｒ2= 0. 9980 ) ，DTG 的线性范围为10. 0～5 000ng·mL－1，定量下限为10. 0ng·mL－1。
精密度与回收率 配制定量下限、低、中－1、中－2、高5个质量浓度水平的质控样品(FNC: 0. 20、0. 60、4. 00、50. 0、75. 0ng·mL－1; DTG: 10. 0、30. 0、200、2500、3750ng·mL－1) ，每个质量浓度水平取 6 个样本分析，连续测定3 个批次，计算批内、批间精密度。同时比较低、中、高3个质量浓度水平经提取与未经提取的待测物 FNC 及 DTG 的峰面积比值，计算回收率。批内批间精密度良好，精密度与回收率结果见表1。
基质效应 在低、中－2、高3个质控浓度水平配制一组含基质样品，即向基质( 6 批不同来源) 的空白提取物中分别加入待测物和内标的溶液，另一组样品是对应相同浓度水平的待测物和内标的不含基质的溶液样品(n = 6) 。计算含基质样品及不含基质溶液样品中待测物峰面积与内标峰面积的比值，得到 FNC低、中－2、高浓度水平下内标归一化基质效应因子分别为 0. 97 ± 0. 07、0. 94 ± 0. 07、0. 93 ± 0. 05，变异系数分别为 7. 55% 、7. 12% 、5. 73% 均低于 15. 0% ，无基质效应; 得到 DTG 低、中 － 2、高浓度水平下内标归一化基质效应因子分别为 0. 96 ± 0. 04、1. 01 ± 0. 02、1. 00± 0. 01，变异系数分别为 3. 81% 、1. 31% 、0. 78% 均低于 15. 0% ，无基质效应。
稳定性 待测物在室温白光条件下放置 52 h、待测物冻融 5 次(－60 ～－90 ℃ /室温、白光) 、待测物冻融 5 次(－10 ～－30 ℃ /室温、白光) 、待测物在－10 ～－30 ℃储存 137 d 和－60～－90 ℃ 储存 137 d、制备后样品在自动进样器(6℃) 放置 779 h( FNC) 、774 h(DTG) 以及自动进样器样品在自动进样器(6℃)放置779 h(FNC) 、758 h(DTG) 的进样重现性，以上条件下均稳定。
采用 Phoenix WinNonlin( 8. 3 或以上版本) 非房室模型计算 FNC 和 DTG 的药代动力学参数。对药代动力学参数Cmax,ss、AUC0－t,ss和AUC0－∞,ss 进行对数转换后进行方差分析，同时计算其几何均值比(联用/单用) 的 90% 置信区间; Tmax,ss采用秩和检验进行统计学检验，评价 FNC 和 DTG 是否存在具有临床显著性的药物相互作用。
结果
受试者连续口服 5 d FNC 单药和 FNC + DTG 联用后血浆中 FNC 和 DTG 的平均血药浓度－时间曲线，见图2。
受试者连续 5 d 口服 FNC 或 DTG 或 FNC + DTG后，血浆中 FNC 和 DTG 的主要药代动力学参数，见表2。
讨论
单用 DTG 与 DTG+FNC 联用后血浆中 DTG 的Cmax,ss、AUC0－t,ss和AUC0－∞,ss 几 何 均 数 比 值 及 其90% 置信区间分别为 103. 68% ( 94. 86% ～113. 31% ) 、105. 06% ( 95. 44% ～115. 65% ) 、104. 38% ( 88. 29% ～ 123. 40% ) ，均 落 在 80% ～125% ;Tmax,ss经非参数法检验无显著性差异( P ＞ 0. 05) 。单用 FNC 与 DTG + FNC 联用后血浆中FNC 的Cmax,ss和AUC0－t,ss几何均数比值及其90%置信区间分别为137. 04% (103. 63% ～ 181. 23% ) 、120. 31% ( 98. 08% ～ 147. 59% ) ，未完全落在 80. 00%～ 125. 00% 范围之内; Tmax,ss经非参数法检验无显著性差异(P＞ 0. 05) 。说明 FNC + DTG 联用未改变DTG的药代动力学特征，但会显著增加 FNC 在体内的暴露量。
15例受试者均按方案要求完成试验，进入安全性分析集。单用 FNC 时受试者共发生8例(10例次) 不良事件; 单用DTG 时受试者共发生11例(18例次) 不良事件; 联用FNC+DTG 时受试者共发生7例(8例次)不良事件。所有不良事件均为1级，均未进行处置和治疗，本研究未发生严重不良事件及可疑且非预期严重不良反应。
本研究遵照《药物相互作用研究技术指导原则(试行)》［3］进行随机交叉前瞻性临床试验，评估健康人体内 FNC 对 DTG 以及 DTG 对 FNC 的药代动力学影响。本试验结果显示: FNC 和 DTG 联合用药时血浆中 DTG 的暴露量无显著变化，而血浆中 FNC 的Cmax,ss和AUC0－t,ss分别升高了 37. 04% 和 20. 31% ，提示 DTG 可能会促进 FNC 体内的吸收过程。FNC主要经细胞色素P450 (CYP) 3A、2D6 /2D1、2C9 /2C6 及2C19 /2C11 代谢，以原型及代谢物形式通过肾排泄;而 DTG 主要经尿苷二磷酸 － 葡萄糖醛酸转移酶 1A1代谢，仅约 10% 经 CYP 代谢［4］，这或许是两药联用应用时 FNC 和 DTG 体内药代动力学过程有差异的原因。
